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高壓細胞破碎儀廠家指導如何提取高質量的RNA

發布時間:2018-12-17   點擊次數:988次

   高壓細胞破碎儀廠家指導提取高質量的RNA的步驟如下:

1、細胞裂解

   細胞的獲取方式不同,采用的裂解方法也不盡相同。

   若是組織中提取,按照每50-100mg樣品加入1ml Trizol的比例加入Trizol,而后勻漿破碎樣品。細胞破碎后在室溫下靜置5分鐘,這樣可以分離出核蛋白復合物(nucleoprotein complexes),然后離心去除細胞碎片。

   若是培養瓶中貼壁細胞,則先用冰PBS洗2次,而后按每10平方厘米區域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混勻處理。

   若是懸浮細胞,離心收集細胞,去除培養基,然后加入適量Trizol吹打混勻處理。

   可以發現這步操作主要用到了Trizol這個試劑。Trizol的主要成分是苯酚,是有效的蛋白變性劑。它能夠抑制酶活性包括RNAaes,這樣可以保證RNA不會被降解掉,同時Trizol能夠使細胞裂解。

2、抽提RNA

   向EP管中的細胞液加入200ul氯仿,渦旋15秒后,室溫靜置3分鐘,然后4℃,12000rpm,15min條件下離心。離心后分3層,上層為無色或淡粉色含有RNA,中層為白色含有DNA,下層為紅色含有蛋白質和脂質。我們所需的RNA由于氯仿的作用就分在上層的水相中。

   氯仿是有機溶劑,添加氯仿會使細胞內的蛋白變性沉淀,可以通過離心進行去除。同時加入氯仿后,水相和有機相會分層,將水相中的酚抽提以免損傷核酸,另外還能溶解一些脂溶性雜質純化RNA。

3、沉淀RNA

   吸取上層水相于新的EP管中,不要吸取中間層或下層的部分,加入等體積的異丙醇,一般是500ul上清和500ul異丙醇,少的時候可以取200ul的上清。兩者充分混勻,室溫放置10分鐘,然后4℃,12000rpm離心10分鐘。離心結束后,棄去上清,管底可見白色膠狀沉淀,這就是RNA了。

4、洗滌RNA

   為了進行RNA的洗滌,需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液,現配現用。DEPC水就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)處理過并經高溫高壓滅菌的MiliQ純水,里面不含雜質RNA,DNA和蛋白質。

   按照添加的Trizon的量1:1體積配乙醇溶液,一般是750ul分析純乙醇加上250ul DEPC水,在渦旋儀上使乙醇溶液與RNA充分混勻,4℃,9000rpm,5min離心。然后小心棄去上清,不要吸走管底的RNA哦。

5、再次洗滌RNA

   重復第四步驟,再次洗滌RNA,棄去上清后,控干EP管。室溫下將EP管倒置在吸水紙上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA,這就是我們終提取到的RNA了。

6、測定RNA純度&濃度

   用微量紫外分光光度計取1-2ul RNA檢測即可。A260/A280值在1.8-2.0間符合純度。RNA在260nm處有大吸收,A260=1.0代表RNA的濃度為40ug/ml。A280用于檢測蛋白污染,純RNA樣品的A260/A280=2.1,一般所得比值在1.8-2.0間也是普遍認可的。另外,我們也可以測定A230。A230用于檢測其他污染,主要來自RNA提取試劑,理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證。

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